一例人狂犬病病例的病毒分離和系統(tǒng)鑒定
摘要：
目的 對2013年武漢市新發(fā)生的一例疑似狂犬病死亡病例的人腦組織進行病毒分離及鑒定。
方法 采用直接熒光抗體法（DFA）及ELISA法檢測狂犬病毒（rabiesvirus，RABV）抗原；提取病毒RNA，設(shè)計12對引物，分段擴增全基因組，克隆后測序，應用DNASTAR軟件包中的MegAlign模塊對基因所編碼的氨基酸進行對位分析；Clustal X 1.83軟件和GENEDOC軟件用于序列比對；Mega4.1軟件以Kimuratwo-parameter模型鄰位相連法（Neighbor-Joining,NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（Bootstrap-1000），并與國內(nèi)外疫苗株及近期湖北省及周邊地區(qū)分離的代表性街毒株進行同源性分析。
結(jié)果 分離的街毒株13WH10的RABV抗原呈陽性；13WH10街毒株基因組全長11,924bp，屬基因Ⅰ型狂犬病毒；13WH10與湖北省及周邊街毒株處于同一亞群，與CTN-1疫苗株及東南亞地區(qū)的街毒株同源性較高，高于歐美國家疫苗株。
結(jié)論 成功對武漢市2013年新發(fā)生的一例疑似狂犬病死亡病例的人腦組織進行病毒分離及鑒定；CTN-1與RABV國內(nèi)分離株同源性較高，系統(tǒng)進化關(guān)系較近，提示采用CTN-1疫苗株生產(chǎn)的狂犬病疫苗可有效預防中國狂犬病的流行。
關(guān)鍵詞：狂犬病毒；街毒株；同源性分析
狂犬病是由狂犬病病毒（rabies virus, RABV）引起的人獸共患性傳染病，病死率幾乎為100%。我國屬狂犬病高發(fā)國家，家犬是RABV的主要宿主和傳染源[1]。目前國內(nèi)分離的人源狂犬病病毒街毒株數(shù)量較少[2-3]，其中僅Ming等[4]對人源街毒株HN10進行過全基因組測序及特征分析。
尸檢是狂犬病確診的方法之一，而與國外相比，國內(nèi)狂犬病患者或疑似狂犬病患者死亡后，尸檢和病因鑒定較少。本研究對2013年武漢市新發(fā)生的一例疑似狂犬病死亡病例取尸體腦組織進行實驗室診斷，采用直接熒光抗體法（DFA）和ELISA法檢測RABV抗原，對分離的病毒全基因組進行測序，并在分子水平與國內(nèi)外的疫苗株及近期湖北省及周邊地區(qū)的街毒株進行遺傳特征差異和系統(tǒng)進化分析，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。
1 材料與方法
1.1 病史資料 本案例屬于一犬咬多人。死者邱某，男，37歲，于2013年3月12日在武漢市青山區(qū)建設(shè)十路被犬咬傷下嘴唇，Ⅲ級暴露；同行者石某，男，48歲，手臂也被此犬咬傷，Ⅲ級暴露。暴露后二人馬上“肥皂水沖洗，擠壓出血”處理傷口，傷人犬已被處死[5]。
2013年3月26日晚（暴露后第15天）邱某突發(fā)嘔吐、舌頭打卷、吐口水、怕風恐水，截止發(fā)病時已接種疫苗4針；后轉(zhuǎn)至武漢市急救中心救治，3月29日9時45分，邱某死亡。石某分別于暴露后第0、3天各接種2針，第7、14、28天各接種1針，共接種7針狂犬病疫苗，至今存活。二者均未注射抗血清或免疫球蛋白。同濟法醫(yī)學司法鑒定中心分離死者邱某人腦組織，委托武漢生物制品研究所有限責任公司狂犬病檢測中心（以下簡稱“本中心”）進行檢測，分離的狂犬街毒株命名為13WH10。
1.2 實驗動物 SPF級1日齡昆明乳鼠5只，由武漢生物制品研究所有限責任公司實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(鄂）2008-0003。
1.3 主要試劑 RABV抗原檢測試劑盒(雙抗體夾心ELISA)由武漢生物制品研究所有限責任公司提供，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗RABV核蛋白單克隆抗體購于美國Millipore公司，TRIzol試劑和superscript ⅢReverse Transcriptase購自美國lnvitrogen公司，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、EXTaq酶和pMDl9-T simple vector 試劑盒購于日本TAKARA，凝膠回收試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit購于德國Qiagen公司。
1.4 引物設(shè)計和合成 根據(jù)人用狂犬病疫苗PV株（Genbank accession no. M13215）基因組序列，并參考表1中RABV株的保守區(qū)序列，使用PrimerPremier 5軟件設(shè)計12對引物，見表2，覆蓋全基因組序列。
1.5 RABV抗原鼠腦傳代 取死者腦樣品海馬回部位組織 0.3 g，加入含青霉素(500 U／ml)及鏈霉素(2 mg／ml)的PBS(pH 7.4)，研磨制備成10％的腦懸液，顱內(nèi)接種1日齡昆明乳鼠5只,每只10μl，連續(xù)21天觀察乳鼠發(fā)病情況[6] 。
1.6 RABV抗原的檢測
1.6.1 DFA檢測 取死者腦樣品海馬回部位組織及RABV傳代乳鼠腦組織印片于載玻片上，冷丙酮室溫固定30min，干燥后加入FITC標記的抗RABV核蛋白單克隆抗體（1：60稀釋），37℃濕盒孵育1 h，PBS漂洗3次，晾干后滴加60％甘油，蓋玻片封片，于熒光顯微鏡下觀察[7]。
1.6.2 雙抗體夾心ELISA檢測 RABV抗原檢測試劑盒檢測死者腦組織和上述接種死者腦海馬組織懸液后發(fā)病的乳鼠腦組織懸液中的RABV抗原[8]。以正常乳鼠腦組織作為陰性對照，CVS-24標準攻擊毒接種的乳鼠腦組織作為陽性對照。
在陰性對照孔A450值 < 0.1、陽性對照孔A450值 > 0.5的條件下，樣品A450值 > 0.4 判定為RABV抗原陽性。
1.7 全基因組分段PCR擴增
用TRIzol試劑提取病毒RNA，以pd(N)6為引物，逆轉(zhuǎn)錄合成病毒基因組cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，用表2中的引物進行PCR擴增。反應體系為：TAKARA Ex Taq 0.26 ul，10×Ex Taq buffer 5 ul，dNTP Mixture 4 ul，模板1 ul，正反向引物各1 ul，去離子水37.74 ul，共50ul。反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1％凝膠電泳鑒定，然后用QIAquickGel Extraction Kit 回收。
表1. 本研究中參考的狂犬病街毒株及疫苗株
Table 1. RABV street strains and vaccine strains refered in thisstudy
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病毒株 |
宿主/用途 |
分離地 |
分離時間 （年） |
Gene序列號
|
|
|
|
標準攻擊毒株 |
法國 |
1882 |
GQ918139 |
GQ918139 |
|
ERA |
獸用疫苗株 |
美國 |
1935 |
EF206707 |
EF206707 |
|
SAD B19 |
人用疫苗株 |
美國 |
1935 |
M31046 |
M31046 |
|
RC-HL |
人用疫苗株 |
日本 |
- |
AB009663 |
AB009663 |
|
HEP-Flury |
人用/獸用疫苗株 |
美國 |
1939 |
AB085828 |
AB085828 |
|
PV |
人用疫苗株 |
法國 |
1882 |
M13215 |
M13215 |
|
CTN-1 |
人用疫苗株 |
中國山東 |
1956 |
FJ959397 |
FJ959397 |
|
3aG |
犬 |
中國北京 |
1935 |
AF155039 |
L04522 |
|
HN10 |
人 |
中國湖南 |
2007 |
EU643590 |
EU643590 |
|
HN06 |
犬 |
中國湖北武漢 |
2005 |
- |
DQ849062 |
|
WH5 |
犬 |
中國湖北武漢 |
2005 |
EU159380 |
DQ849061 |
|
QC |
人 |
中國湖北蘄春 |
2006 |
EU159377 |
DQ849063 |
|
WHQS |
犬 |
中國湖北武漢 |
2007 |
- |
FJ602454 |
|
WHWD |
犬 |
中國湖北武漢 |
2007 |
- |
FJ602455 |
|
WHYF |
犬 |
中國湖北武漢 |
2007 |
- |
FJ602456 |
|
WH11 |
驢 |
中國湖北武漢 |
2011 |
JQ647510 |
JQ647510 |
|
04030PHI |
人 |
菲律賓 |
2004 |
EU086205 |
EU086155 |
|
H-08-1320 |
人 |
斯里蘭卡 |
2008 |
AB569299 |
AB569299 |
|
NNV-RAB-H |
人 |
印度 |
2006 |
EF437215 |
EF437215 |
|
Hum-Trans-IND |
人 |
德國(來自印度) |
2004 |
AY956319 |
AY956319 |
|
8743THA |
人 |
泰國 |
1983 |
EU293121 |
EU293121 |
|
8764THA |
人 |
泰國 |
1983 |
EU293111 |
EU293111 |
注：RC-HL株未查到確切分離時間
1.8 PCR擴增產(chǎn)物克隆和序列測定 將PCR回收純化產(chǎn)物與pMDl9-Tsimple vector連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5a（pMDl9-Tsimple vector自帶），篩選鑒定陽性克隆，提取質(zhì)粒，送南京金斯瑞公司測序。
1.9 序列分析 應用DNAStar軟件包中MegAlign模塊對基因所編碼的氨基酸進行對位分析；ClustalX 1.83軟件和GENEDOC軟件用于序列比對；MEGA 4.1軟件以Kimura two- parameter模型鄰位相連法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(Bootstrap-l000)，并與國內(nèi)外疫苗株及近期湖北省及周邊地區(qū)分離的代表性街毒株（表1）進行同源性分析。
表2 狂犬病病毒街毒株13WH10全基因組測序引物
Table 2. Primersused for sequencing of the complete genome of rabies virus isolate 13WH10
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Sequence (5’-3’) |
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Length (bp) |
Position |
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RV1-F |
ACGCTTAACAACAAAAYCATAGAAGAAGCAG |
|
1012 |
1-1012 |
|
RV1-R |
AAAGTGAATGAGATTGAACACGTGACCAAC |
|
|
|
|
RV2-F |
GCTTACGAAGATTGCTCAGGACTGGTATCA |
|
951 |
764-1714 |
|
RV2-R |
TTAAGGCCAGATGGTTTTCCGTCATCCAGC |
|
|
|
|
RV3-F |
TAACACCCCTCCTTTTGAACCAT |
|
1005 |
1484-2488 |
|
RV3-R |
GTGGTGTTGCCTGTTTTTTTCAT |
|
|
|
|
RV4-F |
CAGGCAACACCACTGATAAAATGAA |
|
678 |
2476-3153 |
|
RV4-R |
TCTCTCCTCCAGAGGTAAACAAGTG |
|
|
|
|
RV5-F |
TGGTGTATCAACATGAATTC |
|
1097 |
3000-4096 |
|
RV5-R |
ACCCATGTTCCG TCCATAAG |
|
|
|
|
RV6-F |
TGTGACATTTTCACCAATAGTAGAGGGAAG |
|
1419 |
3937-5355 |
|
RV6-R |
TTTTTTTCTCGACTGAAAAGCGTAGATGAC |
|
|
|
|
RV7-F |
TCCAAGAACTGATACCAAAGGTGGTGGACA |
|
1396 |
5115-6510 |
|
RV7-R |
ACATCCGTACACAAAAACCAGGTCATGTAT |
|
|
|
|
RV8-F |
AGAGGGCAGAGAAGTTTAGACCTCTTATTC |
|
1360 |
6341-7700 |
|
RV8-R |
CGGTATATAGAAAGGGCATTCCTMGATATG |
|
|
|
|
RV9-F |
TTAYGCCAAAARGGCTGGAGTCTGGTCAGC |
|
1400 |
7501-8900 |
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RV9-R |
CCTTTTAGAGGGCCTCGTGAAAAAAATGAC |
|
|
|
|
RV10-F |
GCAGATCTCTTAAGAGAGATTTCTTGGGGG |
|
1410 |
8701-10110 |
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RV10-R |
TCGTAGGTTAGCTCTCATGCTCTTAGATAR |
|
|
|
|
RV11-F |
CTATTTTGTGTTACCTCCARCATGTGCTGC |
|
1110 |
9911-11020 |
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RV11-R |
GGAGATATAGYTCAGATGAAAAAGACGAGG |
|
|
|
|
RV12-F |
CGGATAACACTkTTGATGTCTGACTTCGCA |
|
1094 |
10831-11924 |
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RV12-R |
ACGCTTAACAAAAAAACAATAAAGACAAAAA AAATAATCAAACAACCAGAGGTTCTG |
|
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|
2 結(jié) 果
2.1 乳鼠發(fā)病情況 1日齡昆明乳鼠接種死者腦組織懸液12d后開始表現(xiàn)出拱背、聳毛、轉(zhuǎn)圈運動、麻痹等狂犬病癥狀，并于發(fā)病后2~3d內(nèi)全部死亡。
2.2 RABV抗原檢測結(jié)果
2.2.1 DFA法 熒光顯微鏡下觀察顯示，死者腦組織樣本均可見不同形狀和大小的綠色熒光顆粒，見圖1，表明RABV抗原陽性。
2.2.2 ELISA法 檢測結(jié)果顯示，死者腦組織樣本A450值為1.616，陽性對照2.346，
陰性對照0.087，表明該樣本RABV抗原陽性；5只傳代乳鼠腦組織的A450值分別為2.127、2.556、2.345、2.170、2.237，陽性對照2.259，陰性對照0.065，表明該樣本的RABV可在乳鼠腦組織中傳代。
A:
B:
A：病人腦組織； B：CVS-24標準攻擊毒株接種乳鼠腦組織；
C：傳代的乳鼠腦組織； D：正常乳鼠腦組織。
圖1 人腦組織樣本 RABV DFA檢測(40×)
Fig.1 DFA detection of RABV antigen in human brain tissue sample(40×)
2.3 13WH10街毒株全基因組測序結(jié)果分析 13WH10街毒株基因組全長11,924bp，與Genbank公布的其他狂犬病病毒基因組類似。3’端58個核苷酸先導序列，N基因（59-1483），P基因（1486-2475），M基因（2481-3283），G基因（3289-5355），L基因（5380-11,854），5，端70個核苷酸尾巴。5種結(jié)構(gòu)蛋白CDS編碼區(qū)序列如下：1353nt N 蛋白（71-1353），894 nt P 蛋白（1515-2408），609 nt M 蛋白（2496-3104），1575ntG 蛋白（3316-4890），6385nt L蛋白（5407-11793）。
2.4 13WH10街毒株N、G基因與國內(nèi)外疫苗株及近期湖北省周邊地區(qū)分離的代表性街毒株的同源性分析 13WH10分離株N基因開發(fā)閱讀框（ORF）全長為1353bp，編碼450個氨基酸的核蛋白。利用核苷酸序列推導的氨基酸序列構(gòu)建進化樹見圖2，圖中顯示，13WH10分離株與湖北省內(nèi)分離株QC、WH11等親緣關(guān)系較近，處于同一亞群。13WH10與近年在湖北省及周邊地區(qū)分離的代表性街毒株N 基因核苷酸序列及推導的氨基酸序列的同源性分別為 88.8%～99.6% 和 99.1%～100%，國內(nèi)外人用、獸用疫苗株N 基因核苷酸序列及推導的氨基酸序列的同源性分別為 86.2%～89.5% 和95.6%～99.1%，東南亞分離街毒株N 基因核苷酸序列及推導的氨基酸序列的同源性分別為 86.6%～88.9%和 98%～99.3%。
注： 13WH10為本研究分離株
圖2 狂犬病病毒13WH10株 N 基因系統(tǒng)進化樹分析
Fig.2 Phylogenetic tree was constructed using the nucleotidesequences of nucleoprotein gene of rabies virus isolate 13WH10 (marked with redtriangle)
G 基因ORF全長1575bp，編碼524個氨基酸，利用核苷酸序列推導氨基酸序列構(gòu)建進化樹（圖3），結(jié)果顯示，13WH10與湖北省內(nèi)分離株WHWD、QC、WH11等親緣關(guān)系較近，處于同一亞群。13WH10與近年在湖北省及周邊地區(qū)分離的代表性街毒株G 基因核苷酸序列及推導的氨基酸序列的同源性分別為87.8%～99.6%和99%～99.6%，國內(nèi)外人用、獸用疫苗株G 基因核苷酸序列及推導的氨基酸序列的同源性分別為82.2%～87.5% 和 87.8%～94.7%，東南亞國家分離街毒株G 基因核苷酸序列及推導的氨基酸序列的同源性分別為83.8%～87.6%和92.6%～94.5%。
N、G基因的進化樹分析均顯示，13WH10與CTN-1同源性高，與國外疫苗株相比，與東南亞地區(qū)的街毒株同源性較歐美國家高；而中國北京分離的3aG株與國外的疫苗株同源性較高，處于另一亞群。
注： 13WH10為本研究分離株
圖3 狂犬病病毒13WH10株 G 基因系統(tǒng)進化樹分析
Fig.3 Phylogenetic treewas constructed using the nucleotide sequences of glycoprotein gene of rabiesvirus isolate 13WH10 (marked with red triangle).
3 討 論
3.1 本病例接種疫苗仍造成死亡的原因 造成本病例死亡的主要原因是“未注射抗血清”。
WHO和我國衛(wèi)生部頒布的狂犬病暴露后處置規(guī)范明確規(guī)定，被瘋動物Ⅲ級致傷者必須徹底清洗傷口、特異性抗體制劑聯(lián)合疫苗接種進行暴露后治療[9]。疫苗接種即使使用高質(zhì)量的細胞培養(yǎng)疫苗，初次免疫后的有效中和抗體也要在免疫后7d左右產(chǎn)生，疫苗免疫后尚未產(chǎn)生中和抗體的這一“空缺”時間，只有應用特異性抗體制劑才能予以填補，這一重要問題經(jīng)過人體觀察和動物實驗已得到充分證實[1，10]。本案例中邱某的暴露部位是下嘴唇，石某的暴露部位是手臂。狂犬病病毒的入侵部位與發(fā)病率密切相關(guān)，暴露部位距離大腦越近，潛伏期越短，發(fā)病率越高，Dean等[11]將狂犬病病毒Flury Lep株接種狐貍頸部和腿部肌肉的研究得到了證實。此外，二人進行傷口處理時采用的“擠壓出血”方法，不符合WHO和我國衛(wèi)生部頒布的狂犬病暴露后處置規(guī)范，應立即用肥皂水、清潔劑、碘或其他對狂犬病病毒有效的殺滅物質(zhì)徹底沖洗傷口至少15分鐘，隨后再進行免疫球蛋白等處理。及時徹底清洗傷口、接種狂犬病疫苗與抗血清能有效預防暴露后狂犬病的發(fā)生[9]。擠壓出血方法可能導致傷口破壞程度更嚴重，更易使狂犬病毒進入傷口周圍細胞及神經(jīng)組織。
3.2 本病例確診為狂犬病的依據(jù)
根據(jù)《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)校準：狂犬病診斷標準》（衛(wèi)生部2008年版），狂犬病的臨床診斷病例必須加上至少一項實驗室檢測的陽性結(jié)果才可確診。DFA（直接免疫熒光法）是WHO推薦的實驗室檢測狂犬病的金標準[7]。雙抗體夾心ELISA法以核蛋白單克隆抗體為基礎(chǔ)，具有較高的敏感性，操作簡便、結(jié)果易于判定，廣泛應用于狂犬病的輔助診斷。上述腦組織樣品用DFA和雙抗體夾心ELISA兩種方法鑒定，均為狂犬病病毒抗原陽性，因此本病例可確診為狂犬病。后續(xù)的病毒分離和全基因組測序分析等方法則可進一步確證本病例的診斷。
3.3 狂犬病病毒13WH10株的系統(tǒng)進化特征
本研究成功從人腦樣品分離出狂犬病病毒13WH10株，并完成全基因測序及特征分析。目前，已有多株疫苗株SAD B19，CTN-1，RC-HL，RV-97等及街毒株HN10，WH11，RRV-ON-99-2，KGH等完成全基因測序分析工作。上述大量研究及本研究結(jié)果顯示，狂犬病病毒屬基因組高度保守，存在大量與病毒在宿主體內(nèi)繁殖擴增相關(guān)的重要結(jié)構(gòu)基序。13WH10與國內(nèi)外疫苗株及周邊地區(qū)街毒株的同源性分析結(jié)果顯示，各病毒株基因組同源性較高，說明狂犬病病毒具有較高的遺傳穩(wěn)定性。疫苗株與其系統(tǒng)進化相近的街毒株大多存在少量核苷酸替換，良好的疫苗株應該與流行區(qū)域的街毒株具有高水平的同源性。
N、G 基因的系統(tǒng)進化樹結(jié)果均顯示，13WH10與湖北省及周邊街毒株（WH11，QC等）處于同一亞群，與CTN-1同源性高，與國外病毒株相比，其與東南亞地區(qū)的病毒株同源性較歐美國家高；而中國北京分離的3aG株與國外的疫苗株同源性較高，處于另一分支。病毒株親緣關(guān)系的密切程度，與病毒的分離地點、宿主來源等密切相關(guān)，分離地越近，宿主來源種屬越接近，則同源性越高[12]。CTN-1與國內(nèi)分離街毒株的同源性較高，系統(tǒng)進化關(guān)系也較近，提示采用CTN-1疫苗株生產(chǎn)的狂犬病疫苗能有效預防中國狂犬病的流行[13]。ZhangYZ等人認為，中國狂犬病街毒株可分為兩大分支：大多數(shù)中國街毒株集中在一亞群，與CTN及東南亞國家分離株高度同源，而另一部分中國街毒株與3aG及國外疫苗株同源性較高，可歸為另一亞群[3]。3aG株及國外疫苗株可能與我國數(shù)年前街毒株的流行趨勢趨同。孟勝利等[14]的研究表明RABV存在著跨地域、跨宿主傳播的現(xiàn)象。Fèvre EM等[15]的研究表明，野生動物和家養(yǎng)動物的貿(mào)易、遷移對病毒類疾病的傳播有重要影響。
3.4 應倡導與狂犬病相關(guān)的尸檢
由于傳統(tǒng)觀念或是其他因素，中國目前死亡病人的尸檢率極低。20%的狂犬病人癥狀不典型，易誤診為其他腦炎，而腦炎病人的死因幾乎都沒有經(jīng)過針對狂犬病的尸檢進行確診。狂犬病診斷的金標準是對腦組織進行特異性熒光抗體檢測。因此，尸檢后取腦組織的實驗室檢查是狂犬病確診的最好方法。因供體攜帶狂犬病病毒通過角膜移植引起受體狂犬病死亡的病例已出現(xiàn)多起[16-17]。2004年美國一男子生前被蝙蝠咬傷，死后將腎臟、肝臟等移植給4位受者，4位患者均因狂犬病死亡[18]。雖然我國目前未報導因器官移植引發(fā)狂犬病的案例，但應當引以為戒：對與腦炎相關(guān)的各種死因，應逐步推廣進行針對狂犬病的尸檢鑒定，以使我國有關(guān)狂犬病的死亡人數(shù)統(tǒng)計更加準確可靠。
目前全球已發(fā)現(xiàn)14種基因型的RABV，新的基因型病毒還在不斷發(fā)現(xiàn)。我國RABV的流行情況非常復雜且特殊，需在更大范圍內(nèi)系統(tǒng)地開展狂犬病的分子流行病學研究，分析RABV街毒株與疫苗株之間的關(guān)系、抗原性之間的差異、及時監(jiān)測病毒株的變異情況，以及RABV在不同宿主之間的跨種傳播和跨地區(qū)傳播的模式。
參考文獻：
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